中文摘要：
无论在医学界、法医界以及竞技体育领域,都对人类实际年龄的准确判断有着较大的需求。尤其在竞技体育领域,准确判定运动员实际日历年龄已经成为了各国在推进体育公平性中面临的最大挑战。但是,由于年龄判定研究不仅需要涉及医学不同领域的知识,甚至需要跨多个行业团队的合作研究,因此尽管这一领域的研究已有较为悠久的历史,但时至今日仍是个有争议的话题。基于骨龄的推算方法是目前判定实际年龄最常用的方法之一,但其准确性受到越来越多的挑战,尤其在体育竞技领域中,运动类型、年限以及青春发育等多种因素都会对骨龄造成较大的影响,单纯依靠骨龄已经无法满足对年龄准确判定的需求。因而,寻求更准确的年龄推断方法显得尤为迫切。本研究在对国内外具有代表性的个体生物学年龄判定研究方法总结后,系统地分析了牙齿形态发育和基因甲基化水平的增龄性变化在儿童青少年生物学年龄判定研究中的特点,并进一步提取与生物学年龄密切相关的各种量化标志性指标,通过建立相关的数学模型,寻找多种量化指标的最佳组合,以期能在现有的水平上,进一步提高个体实际年龄判定的精确性。本研究分两个部分探讨。第一部分基于牙齿形态学的生物学年龄判定方法研究1.研究目的1.1.比较和探索基于牙齿形态学的牙龄判定方法。1.2.整合基于牙齿形态学的各项量化指标,探寻年龄预测模型,以期准确推断实际年龄。2.研究方法和内容本研究属于横断面研究,共纳入952份7~14岁正常样本的口腔曲面断层全景片,其中男孩414人(43.6%),平均年龄为12.14岁(SD 1.81)。首先,依据Demirjian牙齿发育阶段图谱,验证汉族儿童青少年左、右下颌牙齿发育的一致性;进而根据相应的牙龄换算方法,分别获得左下颌7颗恒牙Demirjian法牙龄(M2 M1 PM2 PM1 C I2 I1,简称D7)、4颗恒牙Demirjian法I(M2 M1 PM2 PM1,简称D4I)、4颗恒牙Demirjian法II(M2 PM2 PM1 I1,简称D4II)和Willems法(M2 M1 PM2 PM1 C I2 I1,简称W,为D7法的修正版本)四种牙龄判定值。再次,根据牙齿相关长度和宽度的改变,测量左下颌各恒牙的牙齿、牙髓和牙根的长度,牙根尖、牙体的宽度等,获得Cameriere法相关变量(包括No,S,X1~X7和Xi)和改良Kvall法相关变量(包括单根牙I2、C和PM2的P、T和R等),并验证Cameriere法(欧洲模型)在汉族人群中的应用。最后,采用多元线性回归分析,结合以上基于牙齿发育图谱的4种牙龄判定方法结果和测量法中的相关测量指标分别进行年龄预测模型探索。3.研究结果3.1.左、右下颌恒牙发育基本是一致的,依据Demirjian牙齿发育阶段图谱,两侧下颌牙齿发育阶段的一致率在93%以上,Kappa值0.9以上。说明基于左下颌的恒牙相关测量指标可以代表整体下颌恒牙发育水平。但牙齿的发育有显著性别差异,提示在进行牙龄判断时应考虑性别因素。3.2.各种牙龄判定方法研究3.2.1.左下颌7颗恒牙Demirjian法和Willems法牙龄判定研究该方法包括Demirjian法(D7)和Willems法。与实际年龄相比,除女孩Willems法牙龄外,男孩Willems法和Demirjian法牙龄对实际年龄均有高估(P<0.001),以Demirjian法更加明显。其中,Demirjian法(D7)与实际年龄的差值为1.45年(SD 1.24)(P<0.001),男孩为1.68年(SD 1.29),女孩为1.28年(SD 1.17);Willems与实际年龄的差值为0.16年(SD 1.20)(P<0.001),男孩为0.36年(SD 1.19)(P<0.001),女孩为0.02年(SD 1.18)(P>0.05)。3.2.2.左下颌4颗恒牙Demirjian法牙龄判定方法研究Demirjian 4I法和Demirjian 4II法的预测牙龄对实际年龄均存在高估现象(P<0.01)。男孩Demirjian 4I法牙龄与实际年龄差值为0.88年(SD 1.46);女孩为0.21年(SD 1.39);男孩Demirjian 4II法牙龄与实际年龄的差值为1.24年(SD 1.22年),女孩为0.53年(SD 1.21年)。3.2.3.Cameriere法牙龄研究根据Cameriere法年龄预测模型(欧洲模型),Age=8.387+0.282*sex-1.692*X5+0.835*No-0.116*S-0.139*Sx No,我们得到如下结果:实际年龄为12.15岁(SD1.81),Cameriere法牙龄为9.70岁(SD 2.32),估计年龄与实际年龄的差值为-2.49年(SD1.70)。其中,男孩的实际年龄为11.94岁(SD 1.90),Cameriere法牙龄为9.73岁(SD2.34),比实际年龄低估2.45年(SD 1.75);女孩的实际年龄为12.32岁(SD 1.71),估计牙龄为9.69岁(SD 2.31),比实际年龄低估2.52年(SD 1.66)。无论男孩还是女孩,平均预测误差均大于2.5年以上。说明该预测方程并不合适中国儿童青少年人群。3.3.各种判定方法的比较Demirjian法(D7、D4I和D4II)、Willems法和Cameriere法等五种年龄判定方法中,以Willems法最准确,与实际年龄的差值为0.16年(SD 1.19),估计误差为0.95年,有59.7%的牙龄值与实际年龄的差异在1岁以内。Demirjian法(D7)对年龄的高估现象最明显,与年龄的差值为1.45年(SD 1.24),67.5%的Demirjian法(D7)牙龄比实际年龄高估1岁以上。最不准确的是Cameriere法,79.6%的Cameriere法牙龄比实际年龄低估1岁以上,与实际年龄的差值为-2.49年(SD 1.70),预测误差为2.64年。3.4.年龄预测模型探索我们在分析四种牙龄判定法的基础上,增加了其他牙龄测量指标(包括Cameriere法和改良的Kvall法),对年龄进行预测,得到如下最佳预测方程:Age=9.738+0.284*W-0.019*S*No-3.737*X5-3.746*X3-0.293*RPM2(男孩)Age=6.705+0.38*W-7.053*X4-0.052*S*No+2.863*RC(女孩)进入男孩年龄预测方程有5个变量,女孩的预测方程有4个变量,Willems法牙龄对方程的贡献均最大。男孩的年龄预测方程能解释82.1%的变异,其判定年龄与实际年龄的差值为-0.03年(SD 0.70),MAE为0.56年;女孩的年龄预测方程能解释73.5%的变异,判定年龄与实际年龄的差值为-0.004年(SD 0.84),MAE为0.65年。我们同时对104例含有身高和体重变量的人群数据进行模型探索,获得如下预测方程:Age=-5.799+0.242*W+0.096*Height-2.83*X4(boy)Age=-1.267+0.229*W+0.080*Height+6.561*X6-0.976*X7-0.301*S(girl)该两个方程的预测效力得到了明显的提高,男孩的年龄预测方程能解释89.3%的变异,判定年龄与实际年龄的差值为-0.07年(SD 0.54),MAE为0.43年;女孩的年龄预测方程能解释88.0%的变异,女孩高估0.07年(SD 0.67),MAE为0.56年。但目前该方程使用的样本量少,此处只做探索,建议进一步扩大样本量后再确定。3.5.骨龄、牙龄与年龄的关系探讨我们对收集到的13例样本进行了牙龄、骨龄和年龄关系的初步探讨。左下颌各恒牙中以尖牙、第一前磨牙、第二前磨牙和第二磨牙的发育阶段与骨龄和年龄的相关性最好(P<0.05),相关性最差的是中切牙。骨龄、牙龄和两者的平均值均与实际年龄有着较好的相关性(P<0.01),以Willems法相关性最强(r=0.85,P<0.01);其次是骨龄和Willems法牙龄的平均值(r=0.79,P<0.01);骨龄与年龄的相关系数为0.72(P<0.05)。与实际年龄的差值,骨龄为0.71年(SD 1.74),P>0.05;Willems法为1.28年(SD 1.40),P<0.05;差异最大是Demirjian法(D7)为2.42年(SD 1.68),P<0.05。4.结论4.1汉族儿童青少年左、右下颌恒牙发育基本是一致的,基于左下颌的恒牙相关指标可以代表整体下颌恒牙发育水平。牙齿发育有性别差异,提示在进行牙龄判断时应考虑性别因素。4.2根据牙齿发育形态的增龄性变化来推断个体生物学的年龄是可行的。以Willems法的准确性最高,但建议使用时需进一步修正。准确性最差是Cameriere法(欧洲模型)。Cameriere法(欧洲模型)不适合应用在汉族儿童青少年。4.3针对7~14岁个体,按照下列预测模型进行个体的年龄判定,可提高准确性。该两个预测方程在不同性别中的年龄预测误差在1岁左右。Age=9.738+0.284*W-0.019*S*No-3.737*X5-3.746*X3-0.293*RPM2(男孩)Age=6.705+0.38*W-7.053*X4-0.052*S*No+2.863*RC(女孩)4.4本研究小样本探索了结合牙齿全景片和身高、体重变量的预测模型,该预测模型的预测效力得到了明显的提高,整合多个生物学指标可能将为进一步提高生物学年龄判定的准确性研究提供方向。第二部分DNA甲基化水平与儿童青少年年龄的相关性研究1.研究目的1.1.利用全基因组甲基化芯片技术及生物信息学方法对正常儿童青少年的末梢指尖血进行全基因组甲基化水平研究,筛选年龄相关的基因甲基化位点。1.2.整合基因甲基化位点和个体生物学信息,探索年龄预测模型,以期准确推断个体儿童青少年的实际年龄。2.研究方法2.1.招募68例7~14岁正常儿童青少年,获得65份合格的末梢指尖血样本,并获取包括骨龄、青春期发育的Tanner分期、身高、体重和出生体重等在内的个体基本信息。2.2.纯化和定量基因组DNA,采用人类全基因组甲基化芯片(450K Infinium Methylation Bead Chip),对全基因组中大于450000的Cp G岛或Cp G位点进行甲基化分析。3.结果3.1.根据原始数据情况,我们筛选了与实际年龄的相关系数绝对值大于等于0.5的DNA甲基化位点。共得到44个甲基化基因位点,其中已知基因31个,未知基因13个。已知基因均为蛋白质编码基因,主要分布于基因的内部和上下游,参与人体的细胞生长、转录、分化、运输和代谢等多方面功能。3.2.共44个甲基化位点中,有41个基因位点的甲基化水平与年龄呈负相关,仅有三个基因位点的甲基化水平与实际年龄成正相关。3.3.基于DNA甲基化水平的年龄预测模型探索根据探索性分析,我们得出如下最佳预测方程:Age=13.828+0.425*BA+0.526*sex+0.0001*BW+0.276*Tanner+20.418*cg1-11.828*cg2-5.881*cg3-10.951*cg4+7.828*cg5-5.768*cg8-10.854*cg9-6.048*cg10-9.174*cg11+6.529*cg16-24.577*cg20-8.782*cg23+7.594*cg24+8.399*cg26+7.451*cg27-9.605*cg28+17.739*cg30+18.913*cg38+14.427*cg40-15.420*cg41-9.602*cg42进入方程的变量对方程均有不同程度贡献,其中骨龄对方程的贡献最大,其次是基因PRICKLE2(cg28)和基因APBA2(cg38)。该方程能解释89.5%的年龄变异,估计年龄为10.37年(SD 1.59),对实际年龄低估0.1年,MAE为0.33年。年龄预测误差在0.6年之内,优于其他各个筛选的方程,符合我们的研究要求,但尚待进一步验证。4.结论:4.1.本研究通过全基因组甲基化芯片,首次在儿童青少年群体中完成年龄相关的基因甲基化位点的初步探索,并获得了与年龄显著相关的基因甲基化位点。4.2.在年龄相关的44个基因甲基化位点中,大部分基因甲基化水平与年龄呈负相关。已知的31个基因均为蛋白质编码基因,分布于基因的内部和上下游,主要参与细胞生长、转录、分化、运输和代谢等多方面功能。4.3.我们进行了年龄预测模型相关探索,得出如下可行预测方程,该方程的年龄预测误差在0.6年之内,符合我们的研究要求,但尚待进一步验证。具体方程如下:Age=13.828+0.425*BA+0.526*sex+0.0001*BW+0.276*Tanner+20.418*cg1-11.828*cg2-5.881*cg3-10.951*cg4+7.828*cg5-5.768*cg8-10.854*cg9-6.048*cg10-9.174*cg11+6.529*cg16-24.577*cg20-8.782*cg23+7.594*cg24+8.399*cg26+7.451*cg27-9.605*cg28+17.739*cg30+18.913*cg38+14.427*cg40-15.420*cg41-9.602*cg42(其中,BA:骨龄;BW:出生体重;Tanner:Tanner分期)
