中文摘要：
核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种世界性的死体营养型植物病原真菌,可侵染700多种植物,每年造成严重的经济损失。真菌病毒是一类在真菌中复制和增殖的病毒,在核盘菌中普遍存在。部分真菌病毒侵染可以引致核盘菌致病力衰退,具有绿色防控菌核病的潜力。探究核盘菌群体及单个菌株中真菌病毒多样性,发现、鉴定新病毒,不仅为菌核病防控提供生防资源,也为丰富病毒圈进化的证据提供生物材料。本论文分析了来自澳大利亚的核盘菌中真菌病毒种类及多样性,并对低毒菌株SX276中携带的9种真菌病毒进行分子特性及其对核盘菌影响进行了探究。主要研究结果如下:以来自于澳大利亚16种作物上的84株核盘菌菌株为材料,首次对澳大利亚的核盘菌中病毒多样性进行了分析。生物学特性分析发现84株菌株间在菌落形态和致病力等方面均呈现出明显的分化,其中11株菌株表现出低毒特性。采用宏病毒组测序技术分析核盘菌菌株中的病毒种类。在84株核盘菌中,共测序获得285条与病毒相关contig,代表57种不同真菌病毒的基因组部分序列。基于基因组核酸类型划分,75%为正单链RNA(+ss RNA)病毒,14%为双链RNA(ds RNA)病毒,9%为单股负义链RNA(-ss RNA)病毒,及一个DNA病毒。在+ss RNA真菌病毒中,共发现了25种线粒体病毒,占58%。57种病毒隶属于13个不同的病毒科或属中,包括双分病毒科(4%)、减病毒科(5%)、内源病毒科(11%)、线粒体病毒科(44%)、灰葡萄孢欧尔密病毒科(4%)、芜菁花叶病毒科(7%)、丁型线性病毒科(2%)真菌单股负义链RNA病毒科(14%)、全病毒科(2%)、番茄丛矮病毒科(4%)、真菌多聚病毒科(2%)、葡萄孢双节段病毒属(2%)及真菌DNA病毒科(2%)。基于多重比对及遗传进化分析,57种真菌病毒中有60%(34/57)的新病毒。该发现丰富了现有的病毒资源库,增加了我们对病毒多样性,生态学和进化的整体认知。核盘菌菌株SX276是被9种真菌病毒复合侵染的低毒力菌株。菌株SX276菌落形态异常,产生少而小的菌核,菌丝尖端明显弯曲且分枝增多,对油菜致病力弱,是一株典型的低毒菌株。宏转录组测序的技术及数据组装分析,确定菌株SX276携带有9种不同的真菌病毒,包括7种+ss RNA病毒,1种-ss RNA病毒和1种ds RNA病毒。采用RACE等策略,获得了9种真菌病毒的全长基因组序列。基于基因组序列分析,8种真菌病毒隶属于6个病毒科(减病毒科、内源RNA病毒科、芜菁花叶病毒科、丁型线性病毒科、灰葡萄孢欧尔密病毒科、弹状病毒科)、1个病毒属(灰葡萄孢双节段病毒属)及1种分类地位未确定的病毒,表明菌株SX276中真菌病毒种类复杂。核盘菌丁型线性病毒3(Sclerotinia sclerotiorum deltaflexivirus 3,Ss DFV3)为丁型线性病毒科的一个新成员,但与已发现的芜菁花叶病毒目病毒在基因组结构上显著不同,Ss DFV3基因组有三个RNA组分,编码两个隶属于同一超家族的解旋酶基因,且位于Ss DFV3不同RNA组分上,是首次发现的多节段丁型线性病毒。核盘菌真菌阿尔法病毒1(Sclerotinia sclerotiorum mycoalphavirus virus 1,Ss MAV1)是一个未分类的+ss RNA病毒,其基因组仅有一条RNA片段;虽然在真菌中发现了与Ss MAV1亲缘关系较近的真菌病毒,但显著区别于已知病毒,Ss MAV1基因组编码两个解旋酶结构域,推测该病毒在进化过程中发生了解旋酶基因加倍事件。通过病毒粒子和核酸转染方法分析菌株SX276中欧尔密病毒、灰葡萄孢双节段病毒及减病毒对核盘菌的影响。SX276中两种核盘菌欧尔密病毒的ds RNA或/和ss RNA具有侵染能力,但不影响核盘菌基本生物学表型,灰葡萄孢双节段病毒是潜伏侵染,而减病毒与核盘菌低毒相关。真菌中首次发现弹状病毒。核盘菌弹状病毒1(Sclerotinia sclerotiorum rhabdovirus 1,Ss Rh V1)基因组全长含11356 nt,其5?末端与3?末端反向互补。Ss Rh V1基因组(3?-5?)有5个开放阅读框(ORFⅠ-Ⅴ),推定编码5个蛋白。通过与已知弹状病毒多重比对分析,推定ORFⅠ、ORFⅣ和ORFⅤ分别编码核衣壳蛋白(N)、糖蛋白(G)和复制酶相关蛋白(L),ORFⅡ与ORFⅢ在NCBI数据库中未比对到任何保守的信息,编码未知功能的假定蛋白。Ss Rh V1基因组中有保守的转录起始信号及转录终止信号,但是未发现保守的转录间隔区。Ss Rh V1的L蛋白与水泡病毒属中皮理病毒(Piry virus)有35%的一致性,N和G蛋白也与其他弹状病毒有较低同源性(最高一致性为29%和25%)。系统进化分析表明Ss Rh V1与已知的20个弹状病毒属未聚在一起,而是单独成一个进化分支,表明Ss Rh V1为弹状病毒科的一个新的成员。Ss Rh V1寄主是真菌,且其与已知弹状病毒同源性低,以及基因组结构等特性,建议以Ss Rh V1为模式种,成立一个新的属:核盘菌弹状病毒属(Sclerorhabdovirus)。Ss Rh V1会削弱核盘菌的生长速度,但不影响核盘菌的致病力。核盘菌内源RNA病毒3(Sclerotinia sclerotiorum endornavirus 3,Ss EV3)与核盘菌低毒力相关,是菌株SX276的低毒因子。Ss EV3基因组全长为12631 nt,编码一个多聚蛋白,包含甲基转移酶(Mtr)、解旋酶(Hel)、依赖RNA的RNA聚合酶(Rd Rp)及S7保守结构域。系统发育分析表明Ss EV3与乙型内源RNA病毒属的成员聚为一进化簇,为该属的一个新成员。通过原生质体脱除真菌病毒以及真菌病毒水平传播研究,发现Ss EV3与核盘菌低毒紧密相关,是菌株SX276的主要低毒因子。Ss EV3的侵染引起核盘菌生长速度减慢,菌落形态异常,产菌核能力下降且致病力降低,呈现低毒特性;也能导致菌株抵抗不良非生物环境,包括高盐、高糖及高渗的能力变弱;产酸性物质能力下降,且不能降解酸性物质,在植物表面不能形成侵染垫。本研究对分离自澳大利亚的核盘菌群体及单个低毒菌株的病毒多样性进行研究,发现、鉴定了41种新的真菌病毒,首次在真菌中发现弹状病毒和多节段丁型线性病毒,并明确了内源RNA病毒是菌株SX276的主要的低毒因子,不仅丰富了真菌病毒的种类,为植物病害的生物防治提供了潜在的真菌病毒资源,也为研究病毒进化、生态学提供丰富的生物材料。
